假陽(yáng)性？條帶不對(duì)？菌液PCR問(wèn)題一網(wǎng)打盡

1.平板長(zhǎng)菌，但挑的單克隆菌落搖不起來(lái)？

產(chǎn)生原因及解決辦法：

（1）挑取的單克隆為雜菌，呈假陽(yáng)性。出現(xiàn)這種情況的原因包括：①配制平板過(guò)程中，加入抗生素時(shí)溫度過(guò)高致使抗生素滅活；②配制平板過(guò)程中，抗生素濃度過(guò)低；③平板培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致抗生素失效。

（2）液體培養(yǎng)基的抗生素使用錯(cuò)誤。

（3）液體培養(yǎng)基抗生素濃度過(guò)高，導(dǎo)致大腸桿菌生長(zhǎng)緩慢。

（4）菌液保存太久，導(dǎo)致菌的活力過(guò)低。辦法：重新劃線涂板，挑取單克隆。

（5）自己制備的感受態(tài)細(xì)胞受到雜菌污染。

（6）噬菌體污染?，F(xiàn)象描述：菌液清亮或渾濁后變?yōu)榍辶粒撞坑谐恋?。辦法：甲醛熏蒸超凈臺(tái)，對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)境進(jìn)行消毒；重新提質(zhì)粒，重新轉(zhuǎn)化。

2. 平板長(zhǎng)菌，挑的單克隆菌落能搖起來(lái)，但菌液PCR沒(méi)有條帶？

產(chǎn)生原因及解決辦法：

（1）重組或連接失敗。出現(xiàn)這種情況的原因包括：①質(zhì)粒沒(méi)有切開(kāi)；②質(zhì)粒切開(kāi)后自連。

（2）搖菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，菌液濃度過(guò)大。辦法：搖菌不超過(guò)6小時(shí)，4-5小時(shí)即可。

（3）PCR反應(yīng)體的原因。出現(xiàn)這種情況的原因包括：①酶；②引物。辦法: 換酶，使用熱啟動(dòng)酶；使用載體通用引物。

3. 平板長(zhǎng)菌，挑的單克隆菌落能搖起來(lái)，但菌液PCR與陽(yáng)性對(duì)照的大小不對(duì)？

產(chǎn)生原因及解決辦法：

（1）引物特異性差，導(dǎo)致擴(kuò)增到大腸桿菌的基因。辦法：使用載體的通用引物。

（2）目的基因存在所用酶的酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)切錯(cuò)，僅部分連接，導(dǎo)致片段變小。

（3）小片段核酸污染。這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補(bǔ)后擴(kuò)增出條帶。

（4）瓊脂糖凝膠電泳會(huì)產(chǎn)生偏差，相差一點(diǎn)極有可能是目的條帶。辦法：送測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

4. 平板長(zhǎng)菌，挑的單克隆菌落能搖起來(lái)，但菌液PCR出現(xiàn)多條條帶？

產(chǎn)生原因及解決辦法：

（1）引物特異性差，導(dǎo)致擴(kuò)增到大腸桿菌的基因。辦法：使用載體的通用引物。

（2）Mg2+離子濃度過(guò)高、退火溫度過(guò)低，PCR循環(huán)次數(shù)過(guò)多。

（3）酶量過(guò)多或酶的質(zhì)量差。

（4）菌落污染。

5. 平板長(zhǎng)菌，挑的單克隆菌落能搖起來(lái)，菌液PCR也有目的條帶，但測(cè)序無(wú)信號(hào)？

產(chǎn)生原因及解決辦法：

（1）未連接到載體的目的片段仍存在在菌液里，單克隆的菌落為原始質(zhì)粒，菌液PCR有條帶。

（2）污染。出現(xiàn)這種情況的原因包括：①菌液污染。②酶，引物，Buffer等污染。③氣溶膠污染。

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