石蠟切片HE染色實(shí)驗(yàn)

蘇木精-伊紅染色法 ( Hematoxylin-Eosin staining )，簡(jiǎn)稱HE染色法，切片技術(shù)里常用的染色法之一。蘇木精染液為堿性，主要使用細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.取樣固定

取新鮮的組織樣品，加入4%多聚甲醛組織固定液的EP管中。取樣材料應(yīng)該小而薄，約黃豆粒大小。

2.脫水

采用梯度酒精濃度法脫水。通常選擇50%-60%-70%-90%-95%-100%的濃度梯度，各酒精濃度要求準(zhǔn)確，95%以前各步驟脫水1h，95%和100%均分為兩步進(jìn)行，分別脫水30min，實(shí)驗(yàn)中常將組織在后一步的95%的酒精溶液中過夜，以便進(jìn)行脫脂。

3.透明浸蠟

為了使石蠟更容易進(jìn)入組織，要對(duì)脫水后的組織進(jìn)行透明處理，二甲苯：無(wú)水乙醇（1:1）溶液和二甲苯透明樣品各30ml，在60°C的石蠟溶液中充分浸泡2h。

4.包埋和切片

通過包埋機(jī)，將浸泡后的組織塊使用蠟液包埋后，放到冷臺(tái)上凝固，之后使用刀片進(jìn)行修整，在切片機(jī)上固定好后進(jìn)行連續(xù)切片（5um），所得的切片用銀子在42°C溫水中展開，之后固定在載玻片上，經(jīng)40°C烘干后進(jìn)行HE染色。

5.HE染色

HE染色的程序是將切片浸入二甲苯ⅠⅡ，95%酒精，90%酒精,80%酒精,70%酒工各15min.二甲苯:100%酒精(1 :1),100%酒精Ⅰ,50%酒精,蒸餾水各2 min,蘇木精染液5~10 min,水洗后分化入1%鹽酸酒精5 s,自來水10min,1%氨水藍(lán)化,自來水,50%,70%,80%,90%和95%酒精各2 min,伊紅染液5 min,95%酒精,100%酒精ⅠⅡ,100%酒精:二甲苯(1: 1),二甲苯I、各2 min。中性樹脂封片，不應(yīng)該等切片上的二甲苯干了再封固。

注意事項(xiàng)：

染色過程需要優(yōu)化，染色狀況與組織或細(xì)胞的種類有關(guān)，也隨著生活周期及病理變化而改變；

①固定時(shí)要注意組織在固定液中的位置,并且隨時(shí)翻動(dòng)組織,使其充分固定。

②若組織脫水不凈時(shí)，則會(huì)造成隨后的透明和浸蠟過程中二甲苯和石蠟液無(wú)法滲入組織,所以應(yīng)該保證脫水液體的濃度,并經(jīng)常更換新溶液。

③透明：一般30分鐘就可達(dá)到透明的程度，但溫度較低時(shí)可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間或置于溫箱中加熱。

④浸蠟、包埋：浸蠟和包埋要盡量在恒溫下操作，防止中間出現(xiàn)溫度差，蠟的溫度要適宜，蠟塊中不能出現(xiàn)氣泡、裂隙?斑點(diǎn)?對(duì)于碎小組織要盡可能使其處于同一平面，否則會(huì)造成切片不全與漏切。

⑤切片：在夏季切片時(shí)，為保持蠟塊硬度，可把蠟塊放于冰柜中切時(shí)取出組織蠟塊四周在切片前應(yīng)修齊大小適當(dāng)。不宜過重過猛，容易造成切片厚薄不均，甚至毀壞蠟塊。

⑥染色：染色前切片脫蠟要透徹。染色時(shí)間要根據(jù)染液的新舊適當(dāng)調(diào)整，必要時(shí)在染色過程中用顯微鏡觀察，染色過程中避免陽(yáng)光照射。染色過程中水沖洗不宜太猛。

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