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    PCR凝膠電泳問題,全都總結出來了!

    發(fā)布時間: 2024-05-31  點擊次數(shù): 778次

    1.Marker相關問題

    1.1Marker 不直,偏斜或拖尾

    原因:

    1.膠配制的問題,制作不均勻或有污染或瓊脂糖質量不好;

    2.電泳緩沖液過于老舊,考慮更換;

    3.電壓太高,凝膠受熱導致不均勻;

    4.電泳槽的電極歪斜;


    1.2Maker 跑不開

    原因:

    1.膠濃度太大;

    2.電泳時間太短;


    2.PCR產(chǎn)物相關問題

    2.1沒條帶

    原因:

    沒跑出來


    2.2條帶微弱

    原因:

    1.DNA降解

    2.上樣量過少

    3.沒跑出來,產(chǎn)物濃度過低,需再次PCR


    2.3非特異性擴增

    原因:

    1.引物設計不合理。需重新設計引物,balst檢測引物特異性;

    2.試劑被污染。包括水,酶,引物等。重新更換;

    3.退火溫度太高。提高退火溫度,增加退火時間,減少循環(huán)數(shù);

    4.酶加入過多;


    2.4 PCR產(chǎn)物彌散,拖尾或偏斜,Maker正常

    原因:

    1. 引物保存不當,降解。重新配制引物工作液。

    2.模板降解或過量。重新檢查模板質量,減少模板用量。

    3.非特異性擴增。提高退火溫度,增加退火時間,減少循環(huán)數(shù)。

    4.酶量過多或酶的質量差。

    5. 有蛋白和鹽的污染。


    2.5 PCR產(chǎn)物和Maker 都彌散或拖尾

    原因:

    1.膠配制的問題,制作不均勻或有污染或瓊脂糖質量不好;

    2.電泳緩沖液過于老舊,考慮更換。

    3.電壓太高,凝膠受熱導致不均勻。


    2.6 PCR產(chǎn)物與目的大小不符合

    原因:

    1.引物特異性不好。需重新設計引物,balst檢測引物特異性。

    2.存在新的異構體。

    3.是目的基因,但大小有差異(我遇到過)。膠回收過后再次電泳條帶變?yōu)檎4笮 S龅竭@個情況可以測序看看結果。


    2.7 電泳孔亮

    原因:有蛋白或者多糖的污染,這些大分子物質影響了DNA或RNA的出孔,使其停留在孔中或者出孔很慢。導致孔以及接近孔的位置很亮。

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