小鼠骨髓細胞染色體標本制作實驗

實驗原理：

  在小鼠骨髓細胞中，有絲分裂旺盛，因此可以直接得到中期細胞而不必像血淋巴細胞那樣要經(jīng)過體外培養(yǎng)。骨髓細胞具有高度的分裂活性，經(jīng)秋水仙素（秋水仙堿）處理后，使分裂細胞阻斷在有絲分裂中期，再經(jīng)低滲處理、固定、滴片、染色等步驟，可制作較好的骨髓細胞的染色體標本。通過骨髓得到染色體是比較簡便的，一般也無需無菌操作。在臨床上多用于白血病的研究，在實驗條件下，這種染色體是機體內(nèi)真實情況的反映，而且用骨髓制片的方法易于觀察毒性物質(zhì)在體內(nèi)對細胞和染色體的影響。

實驗方法和步驟：

(一)秋水仙素處理取骨髓前3-4h先給小白鼠經(jīng)腹腔注入0.1％的秋水仙素，注射劑量為4mg／kg動物體重。

(二)取骨髓經(jīng)秋水仙素處理的小白鼠，可用損傷脊髓法（斷頸法）迅速處死，然后用剪刀剪開大腿上的皮膚和肌肉，取出大腿骨和脛骨，用一小塊紗布來回搓干凈附在骨上的肌肉33碎渣。剪掉股骨兩端膨大的關(guān)節(jié)頭，然后將股骨剪碎投入小燒杯中，用2毫升1％檸檬酸鈉溶液攪爛碎骨，使骨髓細胞游離出來。靜止片刻，用吸管把懸浮液吸到離心管中，可重復(fù)沖洗一次。此時離心管中的細胞懸浮液可達4-5毫升。

(三)低滲將所獲得的細胞懸浮液先進行平衡(注意：每次離心前都要平衡)，然后以1000rpm離心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，加0.075M KCL溶液至8毫升刻度，將細胞沉淀物吹散打勻，在水浴37℃低滲20-30min。

(四)固定低滲處理后的材料，以1000rpm離心10min，吸去上清液，留0.2ml沉淀物，用吸管吹散沉淀物，沿管壁加固定液至6毫升,沖勻后靜止固定20min，即第一次固定。按上述條件離心，去上清液，再次加入固定液至6ml，進行第二次固定。20min后離心吸去上清液，留0.2ml沉淀物,再往沉淀物中滴加4滴固定液，沖勻制成細胞懸液。

(五)滴片取事先在冰箱中預(yù)冷的載玻片(載玻片須經(jīng)硫酸洗液浸泡10天以上，經(jīng)清水沖洗，用蒸餾水浸泡)，滴2-3滴細胞懸液于粘有冰水的載玻片上，用嘴吹氣，使細胞迅速分散。將載片插放在切片架上晾干。

(六)染色取2張制片平放在玻璃板上，用10：1 Giemsa染液染色20min，流水沖洗后晾干即可鏡檢（也可以使用苯酚品紅溶液染色）。

(七)觀察用中倍鏡選擇分散適度，不重迭的染色體分裂相，轉(zhuǎn)高倍鏡詳細觀察小白鼠染色體的形態(tài)特征，并計算2n的染色體數(shù)目。

觀察細胞的標準：

1、細胞完整，輪廓清晰，染色體分布在同一水平面上。

2、染色體形態(tài)和分布良好。

3、最好無重疊，即使有個別重疊，也要能明確辯認，以免差錯。

4、觀察的細胞處于同一有絲分裂階段，即染色體螺旋化程度或染色體長短大致一樣。

5、在所觀察的細胞周圍，沒有離散的單個或多個染色體存在，以免影響計數(shù)。

注意事項

1.提前3-4小時注射秋水仙素，時間太長或者太短都會影響染色體中期的數(shù)目和形態(tài)。

2.在低滲過程中，時間和吹打都很重要，低滲過渡會導(dǎo)致染色體膨脹，染色后肥胖，低滲時間不夠，染色后染色體顏色深，看不出條帶。

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