大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)原代培養(yǎng)經(jīng)驗總結(jié)

簡介：

  BMSCs即為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨髓中基質(zhì)細(xì)胞，是骨髓的支持結(jié)構(gòu)，并可作為滋養(yǎng)層支持骨髓中造血干細(xì)胞的生長，因此也被稱為骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。作為干細(xì)胞的一種，它同樣具有多向分化潛能，在一定的環(huán)境和細(xì)胞因子的作用下，可被誘導(dǎo)分化為骨細(xì)胞、神經(jīng)元樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞等。其可被定義為具有多分化能力并且能自我更新復(fù)制的骨髓間質(zhì)細(xì)胞。其各項優(yōu)點，使得它在臨床干細(xì)胞移植治療中顯示出極大的應(yīng)用場景。目前已廣泛使用在修復(fù)軟骨損傷、神經(jīng)細(xì)胞再生等領(lǐng)域。

材料與儀器:

• 燒杯、眼科剪、鑷子、紗布、巴氏滴管、1ml注射器、血清、α-MEM（含L-丙氨酰-L谷氨酰胺/核苷）、PBS、60mm培養(yǎng)皿、T25培養(yǎng)瓶、15ml試管、雙抗（青霉素、鏈霉素）D -hank’s液體

• 血清的保存方式：50ml離心管，分裝凍存-20攝氏度

• 胰蛋白酶的保存方式：25%的胰酶，用的時候-4℃，不用放-20℃凍存

• 高溫滅菌：高溫袋子、滅菌指示帶、燒杯、鑷子

實驗步驟：

(1)配置溶液：

• 50mL的10%培養(yǎng)基：44.5ml的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（現(xiàn)配現(xiàn)用）+5ml FBS（10%）+ 0.5ml雙抗（1%）

• 10ml的2%FBS的培養(yǎng)基：9.7ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.2ml FBS（2%）+0.1ml雙抗（1%)

• 成品雙抗（分裝，20℃下凍存，用1ml離心管分裝）

• 成品PBS：1×：50mlPBS=49.5mlPBS+0.5ml雙抗（1ml凍存液）

• 2×：50mlPBS+49.00mlPBS+1ml雙抗(凍存）

• 4個60mm培養(yǎng)基（分別裝PBS*2、10%FBS的培養(yǎng)基*2/1.5ml）

• 15ml的試管

(2)具體操作：

1、將大鼠脫頸處死，放于裝有酒精的燒杯中備用。給小鼠剝皮的過程可將小鼠置于盛有適量75%酒精的60mm培養(yǎng)皿中進行處理，個人建議每次單人操作不要超過2只小鼠，2只小鼠的細(xì)胞量已經(jīng)足夠，再多會延長提取時間這對細(xì)胞活性是個重大打擊。

2、為避免細(xì)胞污染可將小鼠整個大腿分離后置于含有雙倍雙抗?jié)舛萈BS的60mm培養(yǎng)皿中暫存，待2只小鼠共四只大腿全部分離后在同一培養(yǎng)皿中用眼科剪及眼科鑷分離股骨和脛骨表面的肌肉，我自己分離時喜歡先用剪刀剪開髕韌帶之后順著這個剪開的縫隙將大腿分成股骨和脛骨兩段，然后將脛骨遠端的幾根肌腱用眼科有齒鑷從骨頭上剝離，之后夾住肌肉將其從骨頭上撕下來，把那部分連著的腓骨也剪斷然后剝下來只留一根脛骨，將這段骨頭在另一個干凈的含有1X雙抗培養(yǎng)液的60mm培養(yǎng)皿中暫存。

3、待所有骨頭表面肌肉清理干凈后用剪刀剪開兩端骨骺，注意暴露骨髓腔后的骨頭不要再放回原來的培養(yǎng)皿，可再備另一個含有雙抗培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿用于暫時存放已經(jīng)剪開骨骺的骨頭（骨髓腔內(nèi)為無菌環(huán)境，剪開后放回原培養(yǎng)皿可能導(dǎo)致污染和細(xì)胞損失)。

4、沖洗干凈后將含有骨髓的培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液收集到15ml離心管中用1ml移液槍反復(fù)吹打至無明顯細(xì)胞團后離心去上清（這步也可以去除潛在的細(xì)菌，因為細(xì)菌較輕，如果細(xì)胞間無菌等級高個人認(rèn)為可以跳過離心這步直接講細(xì)胞懸液吹勻后放入培養(yǎng)箱內(nèi)3h后換液）。

5、短時間內(nèi)換液可以有效去除雜細(xì)胞，但為了防止干細(xì)胞的丟失個人建議在第一次換液時將換下的培養(yǎng)液接種到另一個新的培養(yǎng)皿中補加少量培養(yǎng)基放入孵箱內(nèi)等待第一個8h后將2個培養(yǎng)皿同時換液。

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