細(xì)胞自噬的相關(guān)研究，有這篇就足夠了！

自噬（autophagy）被認(rèn)為是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵過(guò)程，也是對(duì)等壓力源的反應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)缺乏，這可能會(huì)危及細(xì)胞的生存。當(dāng)細(xì)胞接觸到這些壓力源時(shí)，原本在低水平發(fā)生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就會(huì)被大幅度上調(diào)。這種上調(diào)會(huì)增加了細(xì)胞的吸收和降解，將大分子釋放回胞質(zhì)中以驅(qū)動(dòng)必須的代謝反應(yīng)并產(chǎn)生能量。

在正常和壓力條件下，自噬對(duì)細(xì)胞健康的貢獻(xiàn)，意味著這種嚴(yán)格調(diào)控和精確協(xié)調(diào)過(guò)程的重要生理和病理作用。事實(shí)上，自噬在哺乳動(dòng)物的發(fā)育過(guò)程中被發(fā)現(xiàn)是有用的。此外，最近的研究發(fā)現(xiàn)自噬是各種疾病和病癥的重要調(diào)節(jié)器。探索自噬在發(fā)育和疾病中的參與，對(duì)于更全面地了解這一途徑的作用至關(guān)重要，并且可能對(duì)保持健康或治療疾病有影響。

自噬的研究已經(jīng)成為如今醫(yī)學(xué)研究的?？?，發(fā)文量也十分巨大，成為常規(guī)生物學(xué)現(xiàn)象來(lái)研究，但是有一些實(shí)驗(yàn)上的技巧值得探討一二，例如一些試劑的使用等等

1、自噬相關(guān)試劑的使用。

①M(fèi)DC:取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其濃度為50 mmol/L,分裝后-20冰箱保存。臨用前用MEM稀釋到終濃度50 umol/L;

②Rapamycin:用MEM培養(yǎng)基配成終濃度為1 umol/L,現(xiàn)用現(xiàn)配;

400ng/ml喹乙醇:稱取4 mg喹乙醇,DMSO預(yù)溶(體積<0.1%)后加入10 ml MEM培養(yǎng)液至*溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光保存;

③3-MA:首先用PBS溶解粉末,臨用前加熱至*溶解后再加入MEM培養(yǎng)基至終濃度10mmol/L;PI3K抑制劑（3-MA，Wortmannin）可干擾或阻斷自噬體的形成；

用RAPAMYCIN誘導(dǎo)自噬我也查過(guò)一部分文獻(xiàn)，有用無(wú)血清的，也有用，一般培養(yǎng)基的，濃度從25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培養(yǎng)基中，目的是排除無(wú)血清所誘導(dǎo)出來(lái)的自噬。

 文獻(xiàn)說(shuō)饑餓初期激活的是大分子自噬，在4-6小時(shí)活力達(dá)到最大，24h后以CMA途徑為主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，貨號(hào)E2888，有碳酸氫鈉，有酚紅的，酚紅到不是很必須，只是一個(gè)PH指示作用，好看些

⑤無(wú)血清誘導(dǎo)自噬：EBSS 誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)就可以了。

EBSS一定可以誘導(dǎo)出來(lái)，只是需要說(shuō)明的是時(shí)間點(diǎn)的設(shè)置，因?yàn)閺酿囸I誘導(dǎo)開始半個(gè)小時(shí)就可能開始自噬了，一直到24小時(shí)都持續(xù)，所以應(yīng)該設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)觀察這個(gè)作用。另外一個(gè)很大的問(wèn)題是，饑餓誘導(dǎo)的一個(gè)很大的弊端是細(xì)胞死亡，這也是我面臨的問(wèn)題，就是在細(xì)胞收養(yǎng)的時(shí)候蛋白濃度太小了。24小時(shí)就很少了，更不要說(shuō)48小時(shí)和72小時(shí)了。

⑥Hank's誘導(dǎo)，也就是通常所說(shuō)的饑餓誘導(dǎo)，細(xì)胞培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后以Hank's替代常規(guī)*培養(yǎng)基，3h后就可誘導(dǎo)出自噬。我用Hank's誘導(dǎo)了3h后電鏡觀察有30%細(xì)胞都有自噬這種現(xiàn)象，但不如國(guó)外報(bào)道的高。

⑦sigma的氯喹的貨號(hào)C6628。用氯喹做自噬抑制劑，293T細(xì)胞50uM就可以。1. 可以用雙蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制劑機(jī)制不同。抑制的步驟也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后續(xù)的步驟，Chloroquine抑制自噬體與溶酶體的融合過(guò)程，autophgy不能完成，所以lc3才會(huì)累積。因此加了抑制劑lc3之后會(huì)比不加的要高。氯喹能提高溶酶體中的pH值，使溶酶體中的酸性水解酶喪失活性，從而導(dǎo)致“自噬溶酶體”不能降解，因此，位于自噬體和自噬溶酶體膜上的LC3不能按時(shí)降解，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3熒光長(zhǎng)時(shí)間的保留或WB中LC3條帶變粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制劑）抑制EV71感染所引起的細(xì)胞凋亡，觀察細(xì)胞的自噬情況。研究發(fā)現(xiàn)，抑制細(xì)胞凋亡能增加LC3-I轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3-II以及p62的降解。

1.   雷帕霉素：作為以mTOR 為靶點(diǎn)尤為經(jīng)典的誘導(dǎo)劑已經(jīng)被廣為應(yīng)用，推薦工作濃度為1μmol-10μmol；

 2.   氯喹：氯喹（Chloroquine）作為溶酶體的抑制劑，可以抑制自噬體與溶酶體的融合從而可以用來(lái)作為自噬以及自噬流的抑制劑用于實(shí)驗(yàn)研究，推薦使用濃度：10umol-50umol。

2、自噬誘導(dǎo)劑

 正常培養(yǎng)的細(xì)胞自噬活性很低，不適于觀察，因此，必須對(duì)自噬進(jìn)行人工干預(yù)和調(diào)節(jié)，經(jīng)報(bào)道的藥物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

 (2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）

 (3) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓

 (4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑

 (5) Rapamycin：mTOR抑制劑

 (6) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑

3、自噬抑制劑

 (1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制劑

 (2) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑

 (3) Hydroxychloroquine（羥氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶體腔堿化劑）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):T7765 ;溶于DMSO中配成儲(chǔ)存液,使用時(shí)DMSO終體積濃度不超過(guò)1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):M9281;溶于滅菌超純水制成儲(chǔ)存液。

氯喹二磷酸鹽(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):C6628;溶于滅菌超純水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品,貨號(hào):R8781;

4、MDC染色焚光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞自睡

單丹黃酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一種突光染料,被用作自吞泡的示蹤劑。具體操作步驟如下:

(1)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞按常規(guī)方法消化后接種于6孔板,每孔接種1x106個(gè)細(xì)胞;

(2)細(xì)胞密度達(dá)到60%-70%時(shí),棄去培養(yǎng)液,小心用PBS洗1遍,分別用含TG濃度為0、0.5、1 nM的培養(yǎng)基及含Rapamycin (終濃度1 pM)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h;

(3)棄上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(終濃度50 nM)的培養(yǎng)基于37 V、5% CCh的恒溫培養(yǎng)箱中避光溫育20 min;

(4)取出六孔板置于勞光顯微鏡下,Ih內(nèi)觀察細(xì)胞自唾發(fā)生情況并拍照。

5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞自噬發(fā)生率

(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞,接種于6孔板,培養(yǎng)24h之后,分別用含TG濃度為0、1、2、4、8uM的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h和0.5uM的TG作用不同時(shí)間(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,將上清收集到4 ml的離心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(終濃度50nM)的MEM培養(yǎng)基,于37°C、5%0?的恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育30 min;

(3)將收集的上清2000rpm,離心5min;

(4)棄掉上清,每管加入500ul含MDC(終濃度50 uM)的MEM培養(yǎng)基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混勻收集到1.5ml的離心管中,2000 rpm.離心5 min;

(6)棄掉上清,加1ml的PBS重懸,2000rpm,離心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鮮育完的上清,2000rpm,離心5 min;

(9)棄掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的離心管中,2000 rpm,離心5 min;

(10)重復(fù)步驟(6)和(7);

(11)將上述兩個(gè)相同濃度或相同時(shí)間點(diǎn)的兩管混勾,過(guò)300目銅網(wǎng)上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞

儀以488nm激發(fā)波長(zhǎng)測(cè)定MDC染色的熒光強(qiáng)度。

LC3B WB: 1:2000

條件是15% SDS-PAGE, 正常跑膠至下沿0.5cm即可，200mA 濕轉(zhuǎn)45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封閉1h，4C過(guò)夜搖動(dòng)孵育，洗抗體3*5min即可

LC3B的Western-blot檢測(cè)，配置的15%的分離膠，濕轉(zhuǎn)250mA，60min

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