用[35S]蛋氨酸和[35S]半胱氨酸標(biāo)記哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法

1. 制備活躍生長(zhǎng)著的細(xì)胞。從單層培養(yǎng)細(xì)胞（約鋪滿 75% 表面積）中吸去培養(yǎng)基。用預(yù)熱至 37℃ 的無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗兩次（培養(yǎng)基中應(yīng)該不含蛋氨酸和半胱氨酸）。對(duì)于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò) 400 g 離心 5 分鐘收集細(xì)胞。用頂熱至 37℃ 的無(wú)蛋氨酸培養(yǎng)基重懸沉淀，400 g 離心 5 分鐘。盡可能地去掉上清，用無(wú)蛋氨酸培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至 107 細(xì)胞/ml 后轉(zhuǎn)移至一塊小培養(yǎng)板。

2. 加入預(yù)熱的無(wú)蛋氨酸和半胱氨酸的培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng) 20 分鐘，以耗盡胞內(nèi)含硫氨基酸庫(kù)。

3. 吸去培養(yǎng)基，立刻換上預(yù)熱的、無(wú)蛋氨酸和半胱氨酸何含有適量標(biāo)記氨基酸的新鮮培養(yǎng)基，依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將細(xì)胞于 37℃ 培養(yǎng)一定時(shí)間（對(duì)于末做過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)的蛋白質(zhì)，以 2~4 小時(shí)作為初始值比較合適）

4. 移去放射性培養(yǎng)基。對(duì)于單層培養(yǎng)細(xì)胞，吸出即可。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞則可轉(zhuǎn)至試管，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。

5. 準(zhǔn)備一塊凍至 0℃ 的平板（如放在冰盒上的鋁板），將單層細(xì)胞培養(yǎng)板放上去。用冰冷的 PBS 沖洗兩次，沖洗液都到進(jìn)放射性廢料桶。懸浮培養(yǎng)細(xì)胞用 PBS 重懸，400 g 離心 5 分鐘，倒去上清。

6. 抽干細(xì)胞上殘留的 PBS，裂解細(xì)胞。